Síntese de Oligonucleotídeos Informação técnica Os oligonucleotídeos são sintetizados utilizando-se um sintetizador de DNA, que é basicamente um sistema computadorizado de liberação de reagentes. A síntese de DNA é um processo cíclico que reúne uma cadeia de nucleotídeos da extremidade 3' para 5'. A primeira base é acoplada em um suporte sólido e monômeros de nucleotídeos são adicionados um a um, através de um ciclo de 4 reações químicas. Na primeira etapa o grupamento dimetoxitritil (DMT) é removido com ácido tricloroacético para liberar a extremidade 5', que irá reagir com o próximo nucleotídeo. Na segunda etapa há o acoplamento, no qual a porção 5'-OH do nucleotídeo reage com o próximo nucleotídeo a ser adicionado. Na terceira etapa, chamada de "capping", há o término de cadeias que não sofreram acoplamento. Cadeias que não reagiram apresentam sua extremidade 5'-OH livres, que serão acetiladas por acido acético anidro e metilimidazol. Esta etapa minimiza as impurezas e impede que as bases que falharam participem do ciclo subsequente. Finalmente, as ligações entre os nucleotídeos são convertidas por oxidação de uma ligação fosfito para uma ligação fosfotriéster mais estável. Após a oxidação o grupamento DMT é removido com ácido tricloroacético e o ciclo é repetido até o alongamento ser completado. As cadeias de DNA sintetizadas são liberadas do suporte sólido pela incubação com uma solução de hidróxido de amônia. Esta solução conterá o oligo com o comprimento requerido e oligos menores que foram excluídos durante a síntese. Estes oligos podem competir entre si e comprometer os resultados de PCR. Assim, processos de purificação adicionais podem ser necessários para que os oligos possam ser utilizados com sucesso. Purificações Nossos oligos são dessalinizados sem custo adicional. Métodos alternativos de purificação incluem: HPLC (High Performance Liquid Chromatography): a purificação por HPLC promove um elevado grau de pureza, sendo recomendada quando os oligos forem usados para diagnósticos ou sondas antisense. PAGE: a purificação por eletroforese é recomendada para oligos maiores que 50 bases. Como escolher o primer certo! Bons resultados em sequenciamentos e produtos de PCR dependem da escolha certa do primer utilizado. Quando escolher um par de primers, leve em consideração as seguintes regras básicas: Escolher primers que apresentem 50% de conteúdo CG; Concentrar a quantidade de CG na extremidade 5'; Não usar sequências ricas em CG na extremidade 3'. Por outro lado, oligos em que os dois últimos nucleotídeos são C ou G são mais estáveis, pois formam "CG clamps"; A temperatura de "melting" do par de oligos deve ser similar ou idêntica; Se os seus oligos forem baseados em introns ou regiões não-codificadoras, esteja consciente sobre a possibilidade de selecionar um primer combinando sequências repetitivas; Alguns dados indicam que a ocorrência de pareamentos inespecíficos é mais frequente em oligos com a presença de T na extremidade 3' do que A, G ou C. Quando mutações são introduzidas no primer evite que elas ocorram nas 3 bases da extremidade 3'; PCR com temperatura de anelamento baixa resulta em produtos não-específicos. Dessa maneira, a temperatura de "melting" de seu oligo deverá ser muito baixa para garantir temperaturas de anelamento mais altas; Sempre verifique se seus oligos podem formar dímeros, "loops" ou "hairpins"; Fazer uma pesquisa (BLAST) de seus oligos no GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Oligos Degenerados Nós sintetizamos oligonucleotídeos degenerados em mistura equimolar sem nenhum custo adicional. Para misturas não-equimolares, um custo adicional será cobrado?consulte-nos através de e-mail, tel ou fax. Nomenclatura internacional Bases A - adenina G - guanosina C - citidina T - timina Bases degeneradas (fazer uma tabela): R A ou G M A ou C W A ou T S G ou C K G ou T Y C ou T B C, G ou T D A, G ou T H A, C ou T V A, C ou G N A, C, G ou T Modificações Há um grande numero de possibilidades para modificações de algumas ou todas as bases num oligo, veja aqui as modificações disponíveis: Modificações disponíveis Fosforilação química 3' end - Phosphorylation 5' end - Phosphorylation Amina 3' - end Amine 5' - end Amine - C6 Thiol 3' - end Thiol 5' - end Thiol Biotina 3' - end Biotin Labeling 5' - end Biotin Labeling Marcadores fluorescentes 3' - end 6-FAM 5' - end 6-FAM 3' - end HEX 5' - end HEX 3' - end TET 5' - end TET 5' - end TAMRA 3' - end TAMRA 5' - end Fluorescein (FITC) 3' - end Fluorescein Labeling 3' - end Cy3 dye 5' - end Cy3 dye 3' - end Cy5 dye 5' - end Cy5 dye Outras 3' - end Dabcyl 3' - end Digoxigenin 5' - end Digoxigenin Bases modificadas deoxi-Inosine (dI) deoxi-Uridina (dU) Corante Black Hole Quencher 3' - end BHQ-1 3' - end BHQ-2 3' - end BHQ-3 Para outras modificações, por favor, entre em contato com nossa Central de Atendimento ao Cliente nos telefones (21)- 2208 2186, (16) 3911-4678, ou se preferir através dos e-mails: custserv@rwgenes.com.br e ribeiraopreto@rwgenes.com.br Escalas Os oligos sintetizados estão disponíveis em duas escalas: 200 nmol e 1000 nmol. 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